Принципы интерпретации результатов ПЦР-тестирования и риски COVID-19

Поскольку пандемия COVID-19 продолжает создавать глобальные проблемы, тестирование методом ОТ-ПЦР (обратной транскрипции полимеразной цепной реакции) остается золотым стандартом для диагностики инфекции SARS-CoV-2. Но сколько людей действительно понимают научные принципы, лежащие в основе этого важнейшего диагностического инструмента? Эта статья предоставляет подробное, но доступное объяснение тестирования методом ОТ-ПЦР, помогая как медицинским работникам, так и широкой общественности лучше понять эту жизненно важную технологию.

ОТ-ПЦР, или полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени, представляет собой высокочувствительную и быструю технику молекулярной биологии, используемую для обнаружения специфического генетического материала в образцах. Этот генетический материал может происходить от людей, бактерий или вирусов, таких как SARS-CoV-2.

Основной технологией, лежащей в основе ОТ-ПЦР, является ПЦР, изобретенная Кари Б. Муллисом в 1980-х годах (за что он получил Нобелевскую премию). ПЦР усиливает и обнаруживает специфические мишени ДНК. Более поздние улучшения позволили визуализировать и количественно оценивать мишени ДНК в «реальном времени» во время амплификации. В ПЦР в реальном времени интенсивность флуоресценции от специализированных зондов коррелирует с количеством амплифицированной ДНК.

Однако стандартная ПЦР обнаруживает только ДНК. Поскольку SARS-CoV-2 содержит генетический материал РНК, для теста требуется фермент обратной транскриптазы для преобразования РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Этот этап обратной транскрипции в сочетании с ПЦР в реальном времени делает ОТ-ПЦР мощным инструментом для обнаружения РНК-вирусов, таких как SARS-CoV-2.

Понимание ОТ-ПЦР требует базовых знаний о генетическом материале — инструкции, которая управляет клеточным и вирусным поведением, выживанием и размножением. Генетический материал существует в двух основных формах: ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота). ДНК имеет двухцепочечную структуру, а РНК — одноцепочечную. Для диагностических целей большая стабильность ДНК делает ее предпочтительной для тестирования на инфекционные заболевания. Примечательно, что SARS-CoV-2 содержит только РНК.

Все вирусы разделяют характеристику зависимости от клеток-хозяев для выживания и репликации. SARS-CoV-2, как и другие вирусы, вторгается в здоровые клетки для размножения. Когда происходит заражение, вирус высвобождает свою РНК и захватывает клеточные механизмы для репликации. Пока генетический материал вируса остается в клетках, ОТ-ПЦР может обнаружить инфекцию SARS-CoV-2.

Обученные медицинские работники собирают образцы мазков из носоглотки, которые затем помещают в стерильные пробирки, содержащие транспортную среду для вирусов, для сохранения целостности вируса.

В лаборатории исследователи извлекают РНК с помощью коммерческих наборов для очистки. Затем образец РНК добавляют в реакционную смесь, содержащую все необходимые компоненты для тестирования, включая ДНК-полимеразу, обратную транскриптазу, строительные блоки ДНК и специфические для SARS-CoV-2 флуоресцентные зонды и праймеры.

Поскольку ПЦР работает только с шаблонами ДНК, обратная транскриптаза преобразует всю РНК в образце (включая РНК человека, бактерий, других коронавирусов и, возможно, РНК SARS-CoV-2) в кДНК.

Этот процесс включает три повторяющихся этапа:

• Денатурация: Нагревание ДНК до >90°C примерно на 10 минут разделяет двухцепочечную ДНК на отдельные цепи.
• Отжиг праймеров: Специально разработанные короткие фрагменты ДНК (праймеры) прикрепляются к специфическим мишеням кДНК SARS-CoV-2 при более низких температурах. Общие генные мишени COVID-19 включают РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRP), ORF1ab, ген S (спайковый белок), ген N (нуклеокапсид) и ген E (оболочка).
• Элонгация: ДНК-полимераза использует праймеры в качестве отправных точек для создания идентичных копий целевых сегментов ДНК.

Процесс повторяется обычно 40 раз, удваивая целевую ДНК с каждым циклом. Флуоресцентные зонды связываются ниже праймеров, высвобождая обнаруживаемые сигналы с каждой амплификацией ДНК. Увеличение целевой ДНК коррелирует с ростом интенсивности флуоресценции.

Данные флуоресценции генерируют «пороговое значение цикла» (Ct) — количество циклов, необходимых для того, чтобы сигнал превысил фоновый уровень. Образцы с большим количеством целевой ДНК усиливаются быстрее, требуя меньше циклов (более низкие значения Ct). И наоборот, дефицит целевой ДНК требует больше циклов (более высокие значения Ct).

Значения Ct предоставляют важную информацию о вирусной нагрузке. Более низкие значения Ct указывают на большее количество вирусного генома, в то время как более высокие значения предполагают меньшее количество. Медицинские работники объединяют значения Ct с клиническими симптомами и историей, чтобы оценить стадию заболевания. Последовательные значения Ct из повторного тестирования помогают контролировать прогрессирование заболевания и предсказывать выздоровление. Контактные лица также используют значения Ct для определения приоритетности пациентов с наибольшей вирусной нагрузкой (и, следовательно, наибольшим риском передачи).

• Вирусная нагрузка: Значения Ct обратно коррелируют с вирусной нагрузкой — более низкое Ct означает большее присутствие вируса.
• Стадия заболевания: Ранняя инфекция обычно показывает высокую вирусную нагрузку (низкое Ct), в то время как на более поздних стадиях нагрузка снижается (растущее Ct) по мере того, как иммунная система очищает инфекцию.
• Риск передачи: Более высокая вирусная нагрузка (более низкие значения Ct) указывает на больший потенциал передачи, что требует более строгих мер изоляции.

Несмотря на то, что ОТ-ПЦР является золотым стандартом диагностики COVID-19, он имеет ограничения:

• Ложноотрицательные результаты: Неправильный отбор проб, низкая вирусная нагрузка или раннее тестирование могут привести к отрицательным результатам, несмотря на фактическую инфекцию.
• Ложноположительные результаты: Редкие, но возможные положительные результаты без фактической инфекции.
• Проблемы стандартизации: Разные лаборатории и платформы могут использовать разные пороговые значения Ct, что усложняет сравнения.

Тестирование методом ОТ-ПЦР остается важным для диагностики COVID-19 путем обнаружения генетического материала SARS-CoV-2. Значения Ct служат жизненно важными показателями вирусной нагрузки, прогрессирования заболевания и риска передачи. Однако ограничения теста требуют объединения результатов с клинической оценкой для точной диагностики и лечения.