Ключевые различия между ПЦР и КПЦР в принципах и применении

Технология амплификации генов, часто описываемая как "фотокопировальная машина" биологической области, играет ключевую роль в диагностике заболеваний, генетических исследованиях и других научных областях.Среди них:, ПЦР и кПЦР кажутся похожими на первый взгляд, но служат различным целям.и особенно их подходы к анализу данных, чтобы помочь исследователям принимать обоснованные решения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод амплификации конкретных фрагментов ДНК.ПЦР использует повторяющиеся циклы нагрева и охлаждения для экспоненциального увеличения последовательностей целевой ДНКЯдром технологии является дизайн праймера - короткие последовательности, дополняющие концы ДНК-мишени, которые направляют ДНК-полимеразу к репликации конкретных областей.

1. Денатурация:Нагрев образца ДНК (94-98°C) отделяет двойную ДНК на одиночные нити.
2. Отжигание:Снижение температуры (50-65°C) позволяет праймерам связываться с целевыми последовательностями.
3. Расширение:При оптимальной температуре полимеразы (72°C) из праймеров синтезируются новые нити ДНК.

Повторение этих циклов быстро генерирует миллионы копий ДНК. Продукты ПЦР обычно анализируются посредством электрофореза гелем агарозы, который разделяет фрагменты по размеру.

• Клонирование генов:Амплификация специфических генов для рекомбинантной конструкции ДНК
• Секвенирование ДНК:Предоставление достаточного образца ДНК
• Диагноз заболевания:Выявление патогенов или генетических мутаций
• Судебная экспертиза:Отпечатки пальцев ДНК

Количественная ПЦР (qPCR) или ПЦР в режиме реального времени представляет собой передовую версию, которая отслеживает амплификацию ДНК в режиме реального времени, позволяя точное количественное определение.Эта технология использует флуоресцентные маркеры, которые коррелируют с концентрацией ДНК..

• Флуоресцентные красители:SYBR Green связывает двойную нить ДНК, при этом флуоресценция увеличивается во время усиления.
• Флуоресцентные зонды:Специфические для последовательности зонды излучают флуоресценцию только при привязке к целям.

Количественное определение зависит от значения порогового цикла (Ct) - цикла, когда флуоресценция превышает фоновую.

• Относительная количественная оценка:Сравнение экспрессии целевого гена между образцами с использованием референтных генов для нормализации
• Абсолютное количественное определение:Определение точного количества копий ДНК с использованием стандартных кривых из известных концентраций

• Анализ экспрессии генов:Измерение уровня мРНК
• Выявление патогена:Количественное определение вирусной/бактериальной нагрузки
• Разработка лекарств:Оценка фармакологического воздействия на экспрессию генов
• Исследования рака:Выявление биомаркеров опухоли

ПЦР обратной транскрипции (RT-PCR) преобразует РНК в комплементарную ДНК (cDNA) для последующей амплификации, что позволяет обнаруживать РНК. Существуют два формата:

• Одноэтапная РТ-ПЦР:Комбинирует обратную транскрипцию и ПЦР в одной трубке
• RT-PCR в два этапа:Выполняет реакции последовательно

Сочетание RT-PCR с qPCR создает RT-qPCR, золотой стандарт для количественной оценки мРНК в исследованиях экспрессии генов.

Анализ ПЦР включает в себя простую визуализацию полос ДНК гелем, указывающую на наличие/отсутствие и относительное изобилие через интенсивность полосы.

Анализ qPCR обеспечивает сложное количественное определение с помощью значений Ct, требуя:

• Исходная коррекция с учетом флуоресценции фона
• Точная установка порога для точного определения Ct
• Анализ кривой плавления для проверки специфичности усиления

Для относительной количественной оценки имеет решающее значение правильный отбор и нормализация ссылочных генов, в то время как абсолютная количественная оценка требует высококачественных стандартных кривых.

Выбор между ПЦР и кПЦР зависит от целей исследования:

• Экспрессия генов:RT-qPCR
• Выявление патогена:qPCR
• Клонирование генов:ПЦР
• Секвенирование ДНК:ПЦР

ПЦР достаточно для обнаружения присутствия/отсутствия, в то время как qPCR необходим для точных требований к количественному определению.