Блог около Ключевые принципы и устранение неполадок для наборов экстракции нуклеиновой кислоты

Экстракция нуклеиновой кислоты служит краеугольным камнем молекулярных биологических экспериментов.Многие исследователи не понимают, что делать., особенно при устранении непредвиденных результатов. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictableЭффективный процесс.

Большинство коммерческих комплектов экстракции нуклеиновых кислот используют технологию спиновой колонны кремниевой мембраны с пятью критическими этапами: лизис клеток, связывание нуклеиновых кислот, промывка и очистка, сушка,и окончательная элюцияКаждый шаг строится на предыдущем, что означает, что любой неверный шаг может поставить под угрозу весь процесс извлечения.

Эффективный клеточный лиз представляет собой важнейший первый шаг.но обычно содержат высокие концентрации хаотропных солей, которые служат двойным целям:

• Денатурация белка:Эти соли нарушают водородные связи, силы ван дер Ваальса и гидрофобные взаимодействия, дестабилизируя белки (включая нуклеазы), чтобы предотвратить деградацию нуклеиновой кислоты.
• Упрощение связывания к кремниевому металлу:Хаотропы вытесняют молекулы воды из нуклеиновых кислот, создавая оптимальные условия для переноса на мембраны кремния.

Общие хаотропные соли включают гидрохлорид гуанидина, тиоцианат гуанидина, мочевину и перхлорат лития.В зависимости от типа выборки, ферменты также могут быть включены. Протеиназа К эффективно переваривает белки в препаратах нуклеиновых кислот, особенно в условиях денатурирования.Хотя его активность уменьшается в условиях денатурирования..

Экстракция плазмиды значительно отличается от РНК или изоляции геномной ДНК.Немедленное добавление хаотропных солей вызовет выделение всех типов ДНК.Поэтому плазмидные протоколы обычно вводят хаотропы после начального клеточного лиза.

Помимо лиза, хаотропные соли облегчают связывание нуклеиновой кислоты с колоннами кремния.Кремниевые колонны содержат смолу, которая избирательно связывает ДНК или РНК в зависимости от концентрации соли и других факторовПолученные нуклеиновые кислоты обладают высокой чистотой и подходят для клонирования, длительного секвенирования и других применений.

Концентрация этанола оказывается критической. избыток этанола осаждает разлагающийся материал и мелкие молекулы, влияя на показания поглощаемости A260.Недостаточное количество этанола может препятствовать выведению соли из мембранОбъемы этанола, предоставляемые комплектом, предварительно оптимизированы, но если деградированная ДНК, по-видимому, искажает показания A260, может помочь повторная оптимизация концентрации этанола.Проточные растворы могут быть сохранены для осаждения для восстановления потерянных нуклеиновых кислотКогда в лизе используются моющие средства, содержащие СДС, NaCl служит эффективным осадителем, который избегает загрязнения моющими средствами.

После центрифугирования лизата через мембраны кремниевого стекла, нуклеиновые кислоты-мишени связываются с колоннами, в то время как белки и полисахариды остаются в потоке.мембраны сохраняют остаточные белки и солиВ образцах растений могут оставаться полисахариды и пигменты; в образцах крови часто появляется коричневое или желтое окрашение.

Типичны два промывания, хотя точное количество зависит от типа образца.после чего промывают этанолом для удаления солейПробы, изначально с низким содержанием белков (например, плазмидные препараты или очистка продукта ПЦР), могут потребовать только промывки этанолом.Некоторые наборы рекомендуют двойную этанольную стиркуОстаточные соли ингибируют элюцию, уменьшая урожайность и увеличивая показания A230, что снижает соотношение A260/230.

Большинство протоколов включают центрифугирование после промывки, чтобы высушить остаточный этанол из колонн.Добавление 10 мМ трисового буфера или воды, затем регидратация нуклеиновых кислот для высвобождения мембраныОстаточный этанол предотвращает полную регидратацию и элюцию.Показательными признаками являются пробы, которые не оседают в гелевых колодцах агарозы (даже при наличии красителя для загрузки) или не способны замерзнуть при температуре -20 °C..

В заключительном этапе экстракции ДНК из кремнезема выделяются чистые нуклеиновые кислоты.ДНК остается более стабильной при слабо щелочном рН и растворяется быстрее в буфере, чем в водеДаже осаждения ДНК ведут себя аналогично. Вода обычно имеет более низкий pH (4-5), а высокая молекулярная масса ДНК может не полностью регидрироваться быстро.Пусть буфер сидит на мембранах в течение нескольких минут до центрифугированияДля применений, требующих нетронутой высокомолекулярной ДНК (например, секвенирование длинного чтения), элюционные буферы оптимальны. РНК переносит слабокислый pH и легко растворяется в воде,делая воду предпочтительным разбавителем.

Даже при соблюдении стандартных протоколов, экстракции могут столкнуться с различными проблемами:

• Низкий урожай:Всегда используйте свежий, высококачественный безалкогольный этанол для разведения буфера и этапов связывания.Некачественный или старый этанол может поглощать влагуПомните, что неправильно приготовленные буферы для промывки могут отделить извлеченные нуклеиновые кислоты!
• Низкая чистота:Загрязнение белка часто происходит из-за чрезмерного количества исходного материала, что увеличивает риск неполного растворения.Использование высококачественного этанола для буферов для стирки, и если проблемы сохраняются, добавить дополнительные шаги мытья.
• Загрязнители:Образцы окружающей среды оказываются особенно восприимчивыми к гумическим веществам, которые сочиняются с ДНК и сопротивляются удалению колонны кремния.Специализированные методы могут удалять мешающие белки и гумики перед связыванием колонны.
• Деградация:РНК сталкивается с большим риском деградации, как правило, из-за неправильного хранения образца или неэффективного лиза (при условии, что используется вода без RNase).деградация имеет меньшее значение для применения ПЦР, но становится критической для длинного чтения последовательности, требующей нетронутой высокомолекулярной ДНК избегать чрезмерного механического лиза!
• Очистка продуктов ПЦР:Хотя это не является строгой экстракцией ДНК, это заслуживает упоминания.Неудачные очистки обычно происходят из-за неудачной ПЦР, но разумно сэкономить поток. Если прозрачные полосы ПЦР не связывают колонны, они, вероятно, остаются в потоке для восстановления и повторной очистки.

Неполный лиз может проявляться как неожиданно низкая урожайность, неполный раствор белка или плохие соотношения A260/230.Это указывает на то, что некоторые компоненты образца не полностью лизируют или растворяются во время экстракции.Различение неполного лиза от загрязнения или деградации требует тщательного анализа условий экстракции, включая состав буфера лиза, параметры инкубации,и потенциально мешающие веществаНапример, плохие соотношения A260/230 могут указывать на остаточные соли после связывания или недостаточное мытье, а не на неполный лиз.Для решения проблемы неполного лиза может потребоваться оптимизация компонентов буфера лиза., время инкубации или с использованием дополнительных методов механического/энзиматического лиза.

Специализированные методы направлены на удаление гуминовых веществ и других интерферентов, которые могут сочищаться с нуклеиновыми кислотами из образцов окружающей среды.К ним относятся специализированные экстракционные буферы, содержащие хелатирующие агенты (e(например, EDTA) для выборочного связывания и удаления катионов.Методы предварительной обработки, такие как дифференциальная центрифугация или фильтрация, могут помочь удалить более крупные частицы из образцов окружающей среды до экстракции нуклеиновой кислоты., уменьшая помехи во время связывания.

Некоторые образцы (например, ткани или материалы с высоким содержанием липидов) представляют особые проблемы.Образцы тканей часто требуют дополнительного механического нарушения или ферментативного переваривания для обеспечения полного лиза и высвобождения нуклеиновой кислоты.. Образцы, богатые липидами, могут осложнять очистку, поскольку липиды могут мешать связыванию нуклеиновой кислоты с колонными матрицами.оптимизация протоколов очистки, или с помощью специально разработанных наборов.

Первоначально опубликован 28 июня 2010 года, пересмотрен и переиздан в мае 2021 и марте 2024 года.