Руководство по ПЦР RTPCR и Qpcr техники объяснены

Вас когда-нибудь путали термины «ПЦР», «ОТ-ПЦР» и «кПЦР» в лаборатории? Не волнуйтесь: эта статья простыми словами объяснит различия между этими методами, что поможет вам более эффективно проводить исследования.

ПЦР, или полимеразная цепная реакция, действует как «копировальный аппарат» ДНК. Этот фундаментальный метод молекулярной биологии, изобретенный Кэри Маллисом, быстро амплифицирует целевые последовательности ДНК in vitro, производя от миллионов до миллиардов копий в течение нескольких часов. ПЦР необходима для клонирования генов, секвенирования ДНК, диагностики заболеваний и многих других приложений.

Процесс ПЦР состоит из трех повторяющихся этапов, которые обеспечивают экспоненциальную амплификацию ДНК:

1. Денатурация:Высокая температура (94-98°С) разделяет двухцепочечную ДНК на одноцепочечные.
2. Отжиг:Снижение температуры (50–65°C) позволяет праймерам связываться с комплементарными целевыми последовательностями.
3. Расширение:ДНК-полимераза (обычно Taq-полимераза) синтезирует новые комплементарные цепи при 72°C.

После 25-40 циклов амплифицированную ДНК можно визуализировать с помощью электрофореза в агарозном геле.

Количественная ПЦР (кПЦР) или ПЦР в реальном времени основана на обычной ПЦР путем включения обнаружения флуоресценции для мониторинга амплификации в режиме реального времени при количественном определении исходного количества матрицы ДНК.

Существуют два основных метода обнаружения флуоресценции:

• ДНК-связывающие красители (например, SYBR Green):Экономичный, но неспецифичный, связывающий всю двухцепочечную ДНК.
• Флуоресцентные зонды:Специализированный, но более дорогой, требующий специально разработанных датчиков.

Ключевым показателем qPCR является значение Ct (пороговый цикл) — номер цикла, когда флуоресценция превышает определенный порог. Более низкие значения Ct указывают на более высокие начальные концентрации матрицы.

Приложения включают в себя:

• Анализ экспрессии генов
• Обнаружение патогенов
• Проверка на наркотики
• Исследования рака

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) сначала преобразует РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы, затем амплифицирует кДНК с помощью стандартной ПЦР. Это позволяет проводить анализ РНК, в том числе:

• Исследования экспрессии генов
• Обнаружение РНК-вируса (например, ВИЧ, гриппа)
• Исследование структуры/функции РНК

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени сочетает обратную транскрипцию с кПЦР для количественного определения уровней экспрессии РНК. Этот метод золотого стандарта широко используется для:

• Точное измерение экспрессии генов
• количественное определение микроРНК
• Исследования длинных некодирующих РНК

qPCR требует тщательно разработанных праймеров и зондов для обеспечения специфичности. Несоответствия могут привести к ложным результатам.

Различные ферменты (например, AMV, M-MLV) различаются по термической стабильности и эффективности, что влияет на выход кДНК.

Неспецифическую амплификацию можно свести к минимуму за счет оптимизации температур отжига и высокоточных полимераз.

Понимание различий этих молекулярных методов позволяет исследователям выбирать подходящие методы для своих конкретных экспериментальных нужд, обеспечивая точные и надежные результаты.