Блог около Руководство по освоению RT-qPCR для анализа экспрессии генов

Обратная транскрипция количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR) стала мощным инструментом для чувствительной и эффективной количественной оценки РНК,революционный анализ экспрессии генов в исследовательских лабораториях по всему мируВ этом подробном руководстве рассматриваются основные принципы и практические применения этой незаменимой технологии.

RT-qPCR сочетает обратную транскрипцию РНК в комплементарную ДНК (cDNA) с количественной амплификацией PCR,позволяет точно измерять уровни РНК посредством флуоресцентного обнаружения во время каждого цикла ПЦРШироко применяется в исследованиях экспрессии генов, обнаружения патогенов и исследования болезней, эта техника предлагает несравненную чувствительность и специфичность.

Исследователи должны решить между двумя основными методологиями (рисунок 1, таблица 1).в то время как двухэтапный подход разделяет эти процессы на отдельные реакции с оптимизированными условиями для каждой стадии.

В то время как мРНК предлагает незначительно более высокую чувствительность, общая РНК обычно обеспечивает превосходную количественную рекуперацию и лучшую нормализацию первоначального количества клеток.Устранение этапов обогащения мРНК предотвращает потенциальное уклонение от дифференциальной скорости восстановления мРНК, что делает общую РНК предпочтительным выбором для большинства приложений, где относительная количественная оценка имеет первостепенное значение.

Двухступенчатая RT-qPCR предлагает четыре основных подхода (рисунок 2, таблица 2):

Ключевые характеристики фермента включают тепловую стабильность для эффективной транскрипции структурированных шаблонов РНК и соответствующие уровни активности РНазы H.В то время как минимальная активность RNase H приносит пользу длительной генерации транскриптов, умеренная активность повышает эффективность qPCR, облегчая растворение дуплекса РНК-ДНК во время начальных циклов ПЦР.

Оптимальные QPCR-праймеры должны охватывать экзон-эксонные соединения, чтобы предотвратить усиление загрязняющей геномной ДНК.Лечение DNase становится необходимым для устранения геномного интерференции ДНК.

Контроль "без RT" служит критической проверкой качества, исключая обратную транскриптазу для обнаружения загрязнения ДНК.Любое усиление в этом контроле указывает на наличие загрязняющей ДНК, которая может поставить под угрозу результаты эксперимента..

Благодаря тщательному рассмотрению этих технических параметров исследователи могут использовать весь потенциал RT-qPCR для создания надежных,воспроизводимые данные экспрессии генов, которые способствуют научному пониманию различных областей исследования.